En mi larga carrera me he especializado en el desarrollo y aplicación de métodos de diagnóstico para la detección de patógenos en plantas. He trabajado en laboratorios federales y privados ofreciendo servicios de diagnóstico de enfermedades de plantas. Mi experiencia trabajando con cultivos hortícolas y frutícolas me ha proporcionado las herramientas para contribuir mis conocimientos en el campo (ayudar con muestreo) y laboratorio (diseño de experimentos). En este articulo describiré los métodos mas comunes usados para detectar y diagnosticar bacterias, hongos, y virus en plantas.
Descripción de las técnicas de laboratorio más comunesCultivo MicrobiológicoLos patógenos fúngicos y bacterianos se pueden aislar y cultivar en medios especializados. Sin embargo, los microorganismos podrán competir entre sí. Frecuentemente, los microbios que crecen más rápido enmascararán a aquellos que crecen más lentamente, lo que dificultaría el diagnóstico de ciertos patógenos bacterianos o fúngicos. El diagnóstico podría estar sesgado y por lo tanto el laboratorio no podrá informar cual es agente causal de la enfermedad a menos que se utilicen métodos moleculares. Sin embargo, en algunos casos, la identificación de la familia taxonómica fúngica (por ejemplo, géneros de la familia Diatripaceae o Botryosphaeriaceae aisladas de un cancro) o género bacteriano (especies de Agrobacterium aisladas de una agalla típica) puede ser suficiente para descifrar la causa del problema. Los fitoplasmas (un tipo especial de bacterias que carecen de paredes celulares) y los virus no pueden cultivarse y su identificación debe realizarse mediante métodos moleculares y/o serológicos.
ELISA, PCR, RT-PCR, qPCR
ELISA es la abreviatura de «ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas», y consiste en la unión una proteína (proteína de cubierta, en el caso de un virus) en una placa de plástico recubierto con anticuerpos específicos. Un cambio de color en los pocillos de la placa indicará una reacción positiva (reacción enzimática colorimétrica). ELISA está limitada a la detección de la cantidad de virus presente en la muestra, por lo tanto, no es tan propensa a la contaminación en el laboratorio. Durante la pandemia de coronavirus, probablemente escuchó en los medios hablar de pruebas de anticuerpos o serológicos. ELISA, aunque diferente de las pruebas rápidas de COVID 19 basadas en inmuno-cromatografía, es una prueba serológica.
PCR, es la abreviatura de reacción en cadena de la polimerasa (esta es una prueba de base molecular). La técnica permite la amplificación de ácidos nucleicos a partir de una mínima concentración de patógeno presente en la planta de vid. El proceso es específico y utiliza copias de pequeñas porciones del genoma del patógeno (llamados cebadores o primers) para iniciar el proceso. La amplificación se repite muchas veces, y cada copia produce más copias, por lo que después de completar un número apropiado de ciclos de PCR, se producen más de mil millones de copias del ácido nucleico. Para los virus de ARN, la detección se realiza mediante RT-PCR (RT es la abreviación de transcripción inversa, una forma molecular de copiar ARN para producir ADN). PCR y RT-PCR son técnicas sensibles utilizadas frecuentemente para la detección de patógenos de la vid. La técnica de PCR en tiempo real es una modificación de la PCR que puede proporcionar la cuantificación relativa del patógeno presente en una muestra (abreviado como qPCR y qRT-PCR). La sensibilidad y la especificidad de la detección de patógenos pueden verse influenciadas por la temporada del año, así como por la parte de la planta en que se recolectan las muestras. Aunque generalmente se piensa que ELISA es menos sensible que PCR, RT-PCR, ELISA tiene un espectro de detección más amplio y puede detectar variantes de un virus. Por otro lado, la técnica de PCR es muy específica, esto puede ser una ventaja, pero también una desventaja. Si la detección es demasiado específica, podría pasar por alto la detección de variantes del mismo virus cuando hay pequeños cambios en el genoma (mutaciones). Esto es común cuando se usa TaqMan, un tipo de qPCR que además de primers utiliza una sonda (probe) específica para la detección de virus u otros patógenos. Esta es la razón por la cual se recomienda utilizar métodos serológicos y moleculares consecutivamente para la detección fiable de virus, ya que cada método está diseñado para detectar diferentes componentes del virus (ELISA detecta las proteínas y PCR detecta el ácido nucleico).
Pruebas Rápidas para la Detección de los Virus
Al igual que aquellos que detectan SARS-COV-2 (el virus que causa COVID19) y el embarazo en el hogar (basados en la inmunocromatografía de flujo lateral) existen kits para detectar patógenos que afectan las plantas. Los kits pueden detectar en unos pocos minutos una variedad de virus y bacterias que producen enfermedades en plantas hortícolas y frutales. Estos kits se comercializan con el fin de realizar las pruebas a campo. Sin embargo, son mucho más precisos cuando las pruebas se realizan en un galpón (mejor aún en el laboratorio) y con cuidado de no contaminar las reacciones. Otros kits disponibles comercialmente para la detección de los virus están basados en el ensayo de amplificación de polimerasa de recombinasa (RPA). Los fabricantes de estos kits afirman que las pruebas pueden realizarse en el campo. Sin embargo, para obtener resultados fiables, los ensayos deben ser realizados por técnicos con experiencia y en el laboratorio. Las personas sin experiencia en estas técnicas deberán leer las instrucciones del ensayo y seguirlas cuidadosamente. Especialmente el protocolo de RPA incluye muchos pasos que requieren medir pequeñas cantidades de reactivos (microlitros). Por lo tanto, es importante que estas pruebas se realicen en un laboratorio. El personal de laboratorio está acostumbrado a ejecutar diferentes protocolos y está capacitado para mantener las muestras y otros materiales libres de contaminación
Amplificación Isotérmica Mediada por Lazo (LAMP)
Al igual que la técnica de PCR, LAMP es un método de amplificación de nucleótidos que utiliza cebadores específicos (primers) para iniciar el proceso de copia del ácido nucleico del patógeno. Sin embargo, difiere en que la reacción a menudo no requiere la extracción de ácido nucleico y se realiza a una temperatura constante (isotérmica). Desafortunadamente, debido a que LAMP es muy sensible, la técnica es propensa a la contaminación (es decir, pueden producir positivos falsos). Al igual que RPA, el operador deberá seguir cuidadosamente un protocolo que requiere la medición de volúmenes pequeños de reactivos, lo que requeriría personal capacitado con experiencia. La inversión inicial de equipos de laboratorio y un área limpia para realizar las operaciones también serán necesarias para producir resultados fiables.
Secuenciación de Ultima Generación (NGS)
La secuenciación de última generación (NGS), también conocida como secuenciación de alta capacidad (High Throughput Sequencing = HTS), es un método poderoso que permite a un laboratorio detectar cualquier organismo presente en una muestra (con tal de que ese organismo haya sido secuenciado anteriormente y registrado en un sistema de datos).
Cuando se aplica NGS o HTS se obtiene la secuencia completa del material genético vegetal y su microbioma. Por lo general, durante la preparación de la muestra, las secuencias específicas de los patógenos pueden enriquecerse para aumentar la sensibilidad del ensayo (por ejemplo, el laboratorio puede preferentemente amplificar las secuencias fúngicas). Los datos obtenidos se analizan con un software sofisticado que es capaz de analizar las secuencias bacterianas, fúngicas, virales u otros microorganismos presentes en la muestra (beneficiosos o patógenos). El método puede proporcionar datos cuantitativos relativos de cada organismo encontrado (generalmente expresados en porcentajes). La técnica de NGS se ha utilizado ampliamente en proyectos de investigación y ha permitido el descubrimiento y la caracterización de importantes virus que afectan plantas. Actualmente, esta técnica se está aplicando comercialmente para testar muestras de plantas y suelos para la detección de microorganismos bacterianos y fúngicos. Se recomienda que un/a fitopatólogo/a con experiencia en taxonomía de bacterias, hongos y/o virus esté disponible para asociar la presencia de los microorganismos encontrados con los síntomas de la enfermedad (o el desarrollo potencial de la enfermedad).
Judit Monis, Ph.D. brinda servicios especializados a productores, administradores de viñedos, huertos, personal de vivero y laboratorios a testar enfermedades causadas por bacterias, hongos y virus. Judit (basada en California) habla español y está disponible para consultas en todas las regiones del mundo. También se pueden programar consultas virtuales. Visite juditmonis.com para obtener información o comuníquese con juditmonis@yahoo.com para solicitar una sesión de asesoría.
